Cell Journal (Yakhteh)
Volume:9 Issue: 2, 2007

ارزیابی کارایی سه روش متفاوت تولید سلول های دندریتیک از سلول های مغز استخوان موش.
سلول های مغز استخوان از موش C57BL/6 استخراج و در فلاسک کشت در حضور GM-(U/ml1000) CSF با (U/ml500) IL-4 و بدون IL-4 به مدت 6 روز کشت داده شدند. کشت سلول های مغز استخوان در پلیت کشت میکروبی به صورت سلول های شناور و در حضور مقدار کم (U/ml200) GM-CSF و به مدت 10 روز به عنوان سومین روش کشت مورد بررسی قرار گرفت. در هر سه روش مذکور سلول ها به منظور بالغ شدن به مدت دو روز دیگر در حضور TNF-a (50 نانوگرم بر میلی لیتر) کشت داده شدند. میزان خلوص سلول های دندریتیک به دست آمده، زیر گروه سلول ها و میزان بلوغ آنها با استفاده از فلوسایتومتری و توان سلول ها در القای پاسخ تکثیری در لنفوسیت های T آلو‍‍ژن با استفاده از اندازه گیری میزان جذب تایمیدین رادیو اکتیو سنجیده شد.
میزان خلوص سلول های دندریتیک به دست آمده (CD11c+) در حضور GM-CSF و IL-4 و در روش کشت سلول ها در پلیت کشت میکروبی نسبت به روش GM-CSF به تنهایی به صورت معنی دار بیشتر بود (به ترتیب 6±72 و 3±69 درصد در مقابل 4±60). در ضمن در روش پلیت کشت میکروبی تعداد زیادتری سلول دندریتیک از هر موش قابل تولید بود، اما این سلول ها در برابر فاکتورهای بلوغ اضافه شده به محیط کشت مقاومت می کردند. میزان بیان شاخص های بلوغ سلول های دندریتیک (MHC class II و CD86) نیز در حضور GM-CSF و IL-4 بیشتر از دو روش دیگر بود و این سلول ها در القای پاسخ های تکثیری در لنفوسیت های T آلوژن نیز قوی تر از دو گروه دیگر عمل می کردند. در ضمن همه روش های به کار گرفته شده در این تحقیق منجر به تولید سلول های دندریتیک میلوئید (CD11b+) شدند.
به طور کلی استفاده همزمان از GM-CSF و IL-4 باعث تولید سلول های دندریتیک خالص تر، بالغ تر و از نظر عملکردی کاراتر نسبت به دو روش دیگر می شود. هر چند روش کشت سلول های مغز استخوان به صورت سلول های شناور و در پلیت کشت میکروبی می تواند تعداد بیشتری سلول دندریتیک تولید کند که در پاره ای مطالعات نظیر استفاده از سلول های دندریتیک تولروژنیک در ایمنی درمانی بیماری های خود ایمن یا در جلوگیری از رد پیوند می توانند کاربرد داشته باشند.

بررسی اثر افزایش بیان پروتئین های شوک حرارتی در سلول های توموری رده MDA-MB468 بر رشد و تمایز سلول های بنیادی خون ساز مشتق از خون بند ناف انسان.
سلول های CD34+ از خون بند ناف انسانی به روش بید مغناطیسی تخلیص و به مدت 14 روز در 3 گروه مختلف در حضور عصاره سلول های توموری (MDA)، عصاره سلول های حرارت دیده (MDA-HSP)، و در حضور سیتوکاین های FLt3L, SCF, IL-3, GM-CSF, TPO (گروه کنترل) کشت شدند. نتایج با شمارش سلول های تکثیر شده، توانایی تشکیل کلونی و تعیین ایمنوفنوتیپ سلول ها توسط آنتی بادی های اختصاصی طی روزهای0، 7 و 14 بررسی شد.
کشت طولانی مدت سلول های بنیادی خون ساز سبب کاهش توانایی تکثیر سلولی و تمایز آنها به سمت رده های میلوییدی و یا لنفوییدی می شود. مقایسه سه گروه نشان داد میزان تکثیر و توانایی تشکیل کلونی در گروه MDA بسیار کمتر از دو گروه دیگر است. بررسی فنوتیپ سلول ها در گروه های مختلف نشان داد که سلول های با شاخص CD19+ (سلولB) در گروه MDA افزایش یافته است. این در حالی است که در گروه MDA-HSP درصد سلول های با شاخص CD56+ (سلولNK) و با شاخص CD14+ (پیش ساز گرانولوسیتی/میلوییدی) و در گروه کنترل تنها درصد سلول های CD14+ افزایش یافت.
سلول های توموری واجد ترکیباتی هستند که بر تکوین سلول های بنیادی خون ساز اثر می گذارند و سبب کاهش تکثیر و توانایی تشکیل کلونی سلول های بنیادی خون ساز می شوند. در عوض سلول های توموری حرارت دیده حاوی HSP و ترکیباتی هستند که سبب حفظ برخی از خصوصیات سلول های بنیادی خون ساز همچون قدرت تشکیل کلونی و تکثیر سلولی می شوند. به نظر می رسد روند تمایز سلول های خون ساز در حضور این ترکیبات درون سلولی به سمت تولید سلول های موثر سیستم ایمنی همچون سلول های NK و میلوییدی باشد که در پاسخ های ضد توموری موثرند. هر چند که برای حصول یک نتیجه قطعی به مطالعات بیشتری نیاز است.

بررسی رابطه بین نقایص اسپرمیوژنز از جمله کمبود پروتامین و سلامت آکروزوم با میزان لقاح و حاملگی در بیماران کاندید IVF.
نمونه های سمن از 70 زوج نابارور مراجعه کننده به مرکز باروری و ناباروری اصفهان جهت انجام IVF جمع آوری شد. بخشی از نمونه های سمن جهت آنالیز پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک، مورفولوژی) بر اساس معیار WHO و بخش اعظم آن جهت انجام IVF آماده گردید. باقی مانده نمونه جهت رنگ آمیزی کرومومایسین A3 و تست ژلاتینولیز به ترتیب برای ارزیابی کمبود پروتامین و فعالیت آکروزین به عنوان شاخص سلامت آکروزوم (میانگین قطر هاله و درصد تشکیل هاله) مورد استفاده قرار گرفت. نتایج با آزمون های آماری ضریب همبستگی و T-Test با استفاده از نرم افزار SPSS-11.5 بررسی و تحلیل شدند.
از لحاظ آماری میزان لقاح رابطه معنی داری را با درصد اسپرم های دارای کمبود پروتامین (CMA3 مثبت)، درصد تشکیل هاله، میانگین قطر هاله و ناهنجاری های مورفولوژیک نشان داد که بالاترین ضریب همبستگی مربوط به درصد تشکیل هاله است. به علاوه از لحاظ آماری بین درصد اسپرم های دارای کمبود پروتامین با درصد تشکیل هاله و میانگین قطر هاله رابطه معنی داری وجود دارد. در مطالعه حاضر، اختلاف معنی داری بین میانگین پارامترهای مذکور در دو گروه افراد واجد حاملگی و فاقد حاملگی مشاهده نشد. اگرچه درصد تشکیل هاله بسیار نزدیک به معنی دار شدن است(p=0.058 و p=0.306).
نتایج بیانگر آن است که اگر چه در طی اسپرمیوژنز تشکیل ساختار آکروزوم و جایگزینی پروتامین در ساختار کروماتین همزمان انجام می گیرد، اما به علت نقش اساسی که آکروزوم در طی روند اتصال به زونا، نفوذ به داخل زونا و همچنین فعال کردن تخمک دارد، احتمالا سلامت آکروزوم نسبت به کمبود پروتامین تاثیر بارزتری را طی روند لقاح به طریق IVF نشان می دهد.

ارزیابی کمی اثر بارگذاری سیکلی بر مورفولوژی سلول های اندوتلیال کشت داده شده.
دستگاه تست بارگذاری سیکلی برای کاربردهای مهندسی سلولی و با قابلیت های تغییر در کرنش، فرکانس و تعداد سیکل بارگذاری و نسبت سرعت کشش به رهاسازی طراحی و ساخته شد. سلول های اندوتلیال ورید بند ناف انسان بر روی غشای الاستیک سیلیکن گرید پزشکی کشت داده شده و در داخل انکوباتور توسط دستگاه فوق تحت بارگذاری قرار گرفتند. تغییرات کمی مورفولوژیکی سلول ها قبل و بعد از اعمال کرنش سیکلی با دامنه 25-10درصد و زمان بارگذاری 10-4 ساعت از طریق نرم افزار طراحی شده پردازش تصویر مورد بررسی مقایسه ای قرار گرفت.
مشاهده شد که آرایش تصادفی سلول های اندوتلیال پس از اعمال بار سیکلی تغییر کرده و در جهت حداقل تغییر شکل ساختار سلول جهت گیری کرده اند که در محدوده بارگذاری این مطالعه، 80-70 درجه نسبت به راستای بارگذاری است. سلول های اندوتلیال پس از بارگذاری کشیده میشوند و در نتیجه شاخص شکل (SI) که معیاری برای کشیدگی است، کاهش می یابد.
مورفولوژی سلول های اندوتلیال تحت بارگذاری سیکلی تغییر می کند به گونه ای که این تغییرات به صورت کمی وابسته به پارامترهای بارگذاری از جمله دامنه و زمان بارگذاری هستند. نتایج این بررسی در آسیب شناسی سلول های اندوتلیال ناشی از فشار خون بالا و در بازسازی عروقی ناشی از تغییرات بارگذاری های متفاوت بر سلول های اندوتلیال به دلیل موج های فشار خون متفاوت اهمیت می یابد.

بررسی شباهت ها و ارتباط ژنتیکی ژرم لاین و نیز بیولوژی تولید مثلی گوسفند اهلی (Ovis aries) با گونه وحشی قمیشلو (Ovis orientalis Isphahanica) جهت انجام مطالعات پیشرفته تر از قبیل شبیه سازی بین گونه ای.
شش گوسفند وحشی و اهلی انتخاب و از نظر تهیه بیوپسی و بررسی کاریوتیپ، توانایی جفت گیری و باروری بین گونه ای مطالعه شدند.
گوسفندان وحشی و اهلی، جمعیت کروموزومی یکسان (54=2n) داشتند و قادر به جفت گیری و ایجاد آبستنی موفق در گونه متقابل بودند. هیبریدهای حاصله (نر و ماده) از آمیزش قوچ وحشی، میش اهلی و نیز قوچ اهلی، میش وحشی جمعیت کروموزومی برابر با یکدیگر و والدین خود داشتند. ساختارهای تولید مثلی و نیز باروری طبیعی در افراد بالغ هر دو نوع هیبرید ثبت شد.
نتایج حاصله بیانگر ارتباط دودمانی تنگاتنگ بین گونه های اهلی و وحشی مورد مطالعه است و امکان استفاده از پتانسیل تولید مثلی گونه های اهلی در جهت حفظ خصوصیات ژنتیکی گوسفند وحشی قمیشلو از طریق شبیه سازی را قابل طرح می داند.

بررسی اثر افزایش اولیه فاکتور آلفا نکروز دهنده تومور (TNF-a) در فنوتیپ و عملکرد سلول های دندریتیک مشتق از سلول های منوسیت خون بند ناف.
سلول های تک هسته ای از خون بند ناف افراد سالم جدا و به دو گروه تقسیم شدند، در هر دو گروه از محیط کشت حاوی ترکیبات سایتوکاینی GM-CSF, SCF, Flt3L و IL-4 استفاده شد. با این تفاوت که در گروه (+)TNF، به ترکیبات سایتوکاینی فوق میزان 3 نانوگرم بر میلی لیتر TNF-a در روزهای 0، 7 و 14 اضافه شد، و در گروه (-)TNF، هیچ ترکیب دیگری به سایتوکاین های فوق اضافه نشد. سلول ها در هر دو گروه به مدت 14 روز کشت شدند و سپس در روز 14 به منظور القای بلوغ 10 نانوگرم بر میلی لیترTNF-a و یا 1 نانوگرم بر میلی لیتر LPS به محیط کشت اضافه شد و کشت به مدت 4 روز دیگر ادامه یافت. در روزهای 0، 7 و 14، مورفولوژی و فنوتیپ سلول ها توسط میکروسکوپ نوری و فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت و عملکرد سلول های دندریتیک بالغ و نابالغ نیز توسط واکنش مختلط لکوسیتی و سنجش سیتوکاین های 12-IL و 10-IL ارزیابی شد.
هم کشتی سلول های بنیادی خون ساز و منوسیت های خون بند ناف، سبب تولید سلول های دندریتیک با ظاهر ویلی دار شد که شاخص های سلول های دندریتیک را بیان می کردند. افزایش اولیه TNF-aسبب افزایش بقای سلول ها در هفته اول کشت و تولید DC های بالغ با شاخص های بلوغ بیشتر شد که توانایی ترشح مقادیر زیادی 12-IL را دارا بودند. در عوض، افزایش TNF-a تنها به عنوان فاکتور بلوغ و در انتهای کشت، سبب تولید مجموعه هتروژنی از سلول های DC بالغ، نابالغ و سلول های بنیادی شد که توانایی ترشح 12-IL کمتر و 10-IL بیشتری داشتند. در هر دو گروه DC بالغ سبب افزایش تکثیر T آلوژن شد.
در این مطالعه روشی ساده و کم هزینه برای تولید سلول های دندریتیک از سلول های تک هسته ای خون بند ناف بدون انجام مراحل دشوار تخلیص سلولی ارایه شده است و مشخص شد حضور TNF در روزهای اولیه کشت و نیز حضور سایر سلول های تک هسته ای منجر به تولید سلول های دندریتیک هموژن تر با توانایی تولید 12-IL از مسیر CD14 می شود. به نظر می رسد TNF با اثر بر سلول های دندریتیک و منوسیتی که در مخلوط سلولی وجود دارند، سبب ورود سلول های بنیادی خون ساز به مسیر میلوییدی می شوند و منجر به تولید سلول های دندریتیک از نوع DC1 می شوند. این روش مدلی ساده برای پیگیری پیامد تمایز سلول ها دندریتیک در حضور TNF-a که در شرایط التهابی و برخی بیماری ها همچون آرتریت روماتویید افزایش می یابد، ارایه میدهد.

تکثیر سلول های بنیادی اسپرماتوگونی بالغ در محیط آزمایشگاه پس از هم کشتی با سلول های سرتولی و تیمار با سایتوکاین های SCF، GM-CSF و GDNF همچنین القای اسپرماتوژنزیس در موش گیرنده مدل آزواسپرمی از طریق پیوند سلول های کلونی حاصل از کشت با استفاده از دو مرحله هضم آنزیمی، تعلیق سلولی حاوی سلول های ژرم و سرتولی از بیضه موش بالغ به دست آمد. سلول های اسپرماتوگونی با جداسازی سلول های بافت بینابینی، اسپرماتید، اسپرم، اسپرماتوسیت و سرتولی خالص سازی شدند. سلول های سرتولی با استفاده از ظروف پوشیده از 5 میکروگرم بر میلی لیتر لکتین داچورا استرامونیوم اگلوتینین (DSA) در بافر فسفات جدا شدند. ماهیت سلول ها علاوه بر ریخت شناسی و فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، از طریق نشانگرهای اختصاصی Oct-4 در سلول های کلونی های حاصل و ویمنتین در سلول سرتولی تایید شد. پس از خالص سازی، تعلیق سلولی حاوی سلول های بنیادی اسپرماتوگونی به صورت هم کشتی با سلول سرتولی و افزودن سایتوکاین ها و فاکتورهای رشد SCF (با غلظت های 1 نانوگرم بر میلی لیتر، 40 نانوگرم بر میلی لیتر و 100 نانوگرم بر میلی لیتر)، GM-CSF (با غلظت های 0.1 نانوگرم بر میلی لیتر، 0.01 نانوگرم بر میلی لیتر، 1 نانوگرم بر میلی لیتر) و GDNF (با غلظت های 1 نانوگرم بر میلی لیتر، 40 نانوگرم بر میلی لیتر و 100 نانوگرم بر میلی لیتر) کشت داده شد. یک هفته پس از کشت سلول ها پاساژ داده شد. طول دوره کشت 3 هفته بود و ارزیابی کلونی (اندازه گیری قطر و شمارش تعداد کلونی) در پایان هر هفته و با میکروسکوپ نوری انجام گرفت. سلول های اسپرماتوگونی کلونی های حاصل از کشت پیوند و به کمک BrdU ردیابی و دو هفته بعد از پیوند بررسی شد.
یافته های پژوهش نشان داد که هم کشتی با سلول سرتولی در مقایسه با سایر گروه های آزمون و گروه کنترل به طور معنی داری باعث افزایش قطر (50.01±205.8 میکرومتر) و تعداد کلونی (5.2±25.1) در محیط کشت می شود (0.001< p). همچنین در بین گروه های تیمار شده با سایتوکاین و فاکتور رشد، GDNF با غلظت 100 نانوگرم بر میلی لیتر افزایش معنی داری را در قطر کلونی (46.8±144.7 میکرومتر) نسبت به گروه کنترل (27.4±95 میکرومتر) نشان داد (0.05

نتیجه گیری

تکثیر سلول های اسپرماتوگونی به کمک سیستم هم کشتی، راهی مناسب در افزایش تعداد سلول های بنیادی اسپرماتوگونی و کمک به درمان ناباروری است.

کلیدواژگان: اسپرماتوگونی، سلول سرتولی، سیستم هم کشتی، سایتوکاین، کلونی زایی

استفاده از آنزیم اکتینیدین میوه کیوی (Actinidia deliciosa) به منظور جداسازی سلول های اندوتلیال بند ناف انسان.
اکتینیدین در دامنه غلظت 1 تا 16 میلی گرم در میلی لیتر و زمان 10 تا 60 دقیقه برای جداسازی سلول های اندوتلیال مورد آزمایش قرار گرفت. سلول های جدا شده در محیط کشت MCDB131 کشت داده شدند. تشخیص سلول های اندوتلیال با شواهد مورفولوژیک و روش ایمونوسیتوشیمیایی و درصد زنده بودن سلول ها با آزمون تریپان بلو انجام گرفت.
اکتینیدین در غلظت 4 میلی گرم در میلی لیتر به مدت 30-20 دقیقه توانست به طور انتخابی سلول های اندوتلیال سیاهرگ بند ناف را جدا کند. درصد بقای سلول های اندوتلیال جدا شده 95-90 درصد تخمین زده شد.
نتایج نشان داد اکتینیدین اثر سمی بر سلول ندارد و در مقایسه با کلاژناز کارایی بسیار مطلوبی در جداسازی سلول های اندوتلیال از سیاهرگ بند ناف انسان دارد.